IonWorks Quattro
高通量電生理學(xué)篩選
在制藥工業(yè)上，離子通道是一類高效而且尚未闡明的靶點(diǎn)。傳統(tǒng)的一次性單細(xì)胞膜片鉗是研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”，這種方法需要大量的人力，而且不適合早期藥物研發(fā)中進(jìn)行大量化合物的篩選。因此，作為離子通道活性研究的替代方案，使用例如配體置換，離子通量和膜電位技術(shù)，不過由于缺少電壓控制，這些實(shí)驗(yàn)無法將一些離子通道維持在某種構(gòu)象狀態(tài)。最近的膜片鉗技術(shù)開啟了離子通道篩選的新紀(jì)元，使用直接電生理學(xué)測(cè)定，可以使用幾種設(shè)備，包括來自分子儀器公司的IonWorks? HT 和 PatchXpress? 7000A 系統(tǒng)。盡管這些系統(tǒng)比起傳統(tǒng)的膜片鉗提供了相當(dāng)高的通量，不過仍然急需要能夠匹配替代實(shí)驗(yàn)的通量，同時(shí)降低每一個(gè)化合物測(cè)定的成本。為了達(dá)到這樣的目標(biāo)，分子儀器公司開發(fā)了具有Population Patch Clamp? (PPC)技術(shù)的IonWorks? Quattro?系統(tǒng)。
來自分子儀器公司的 IonWorks? Quattro? 系統(tǒng)—下一代離子通道篩選工具:
◆Population Patch Clamp?技術(shù)
◆一致性和數(shù)據(jù)質(zhì)量
◆hERG藥理
◆與原來PatchPlate?的兼容性
◆超過FIonWorks? HT 4倍的通量
◆減少每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的成本
◆規(guī)格
Population Patch Clamp? 技術(shù)
生物差異（例如細(xì)胞健康，細(xì)胞大小和通道表達(dá)水平）是在平面膜片鉗系統(tǒng)中降低成功率的主要因素。為了糾正這些因素，IonWorks
HT系統(tǒng)最初設(shè)計(jì)用來增加對(duì)一式四份中每個(gè)化合物通過吸液管混合獲得至少一個(gè)成功記錄的可能性。因此對(duì)每個(gè)化合物使用一個(gè)細(xì)胞獲得至少一個(gè)成功紀(jì)錄的70%的可能性是99.2%；可是通量太低。通過消除一式四份的方法，在IonWorks系統(tǒng)可以迅速的實(shí)現(xiàn)4倍通量的增加。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，分子儀器公司開發(fā)了Population
Patch Clamp? (PPC) 技術(shù)，這種創(chuàng)新性方法記錄了一個(gè)表達(dá)重組電壓門控離子通道的細(xì)胞株中的平均離子電流。細(xì)胞被接種到384孔的PatchPlate
PPC?基片上，每個(gè)通道包含了多個(gè)記錄點(diǎn)(圖 1).
![圖 1. IonWorks Quattro 系統(tǒng)使用Population Patch Clamp? 技術(shù)。每個(gè) PatchPlate PPC 基片上包含了多個(gè)記錄點(diǎn)。]()
一致性和數(shù)據(jù)質(zhì)量
因?yàn)殡x子電流從一個(gè)細(xì)胞株測(cè)量得來，試驗(yàn)期間IonWorks Quattro 系統(tǒng)在各個(gè)孔中測(cè)量的平均電流具高度的一致性。IonWorks Quattro
系統(tǒng)測(cè)量的電流的變異系數(shù)大大降低了。對(duì)于IonWorks Quattro 和IonWorks HT
系統(tǒng)，Kv1.3電流的%CV分別是8%和34%；Nav1.5電流的%CV分別是18%和44%；hERG電流分別是28%和50%。 來自于PPC記錄的原始數(shù)據(jù)在圖2中顯示。
![圖 2. 在 IonWorks Quattro使用PatchPlate PPC 基片測(cè)量的Kv1.3, Nav1.5 和hERG 電流的原始數(shù)據(jù)。]()
如此高的成功率 (超過 95%, 表1) 未必要采用測(cè)試多余的4通道的化合物，因此比起第一代IonWorks HT 系統(tǒng)，立刻提高了4倍的通量。用Kv1.3 , Nav1.5 和 hERG
表示的細(xì)胞成功率總結(jié)在表1。
表 1. 比較 IonWorks Quattro 和IonWorks HT 系統(tǒng)的百分率 (%).
|
PPC |
Single Hole |
| 離子通道 (雙向) |
平均值 |
SD |
平均值 |
SD |
| Kv1.3 (CHO) |
99.3 |
0.5 |
80.1 |
7.7 |
| Nav1.5 (CHL) |
95.5 |
3.2 |
71.3 |
7.1 |
| hERG (CHO) |
97.3 |
2.4 |
61.0 |
12.0 |
雙尾的不配對(duì)T-檢驗(yàn) p
< 0.01.
提高的數(shù)據(jù)質(zhì)量帶來了對(duì)于穩(wěn)定性離子通道靶點(diǎn)單點(diǎn)篩選和藥理實(shí)驗(yàn)所需的穩(wěn)定性和一致性。 在IonWorks Quattro 試驗(yàn)中，通道間的變化穩(wěn)定，可以獲得穩(wěn)定的Z-因子，與FLIPR?
系統(tǒng)中Z-因子值相近(圖 3)。
![圖 3.在IonWorks Quattro 試驗(yàn)中，通道間的變化穩(wěn)定，可以獲得穩(wěn)定的Z-因子，與FLIPR? 系統(tǒng)中Z-因子值相近]()
IonWorks Quattro 系統(tǒng)增加的通量對(duì)于很多在單個(gè)試驗(yàn)中的化合物，可以產(chǎn)生理想的復(fù)雜藥理結(jié)果。使用96- 或者 384-孔混合, 可以設(shè)計(jì)各種各樣的劑量反應(yīng)試驗(yàn)，包括從3-12
濃度的各種滴定—有或者沒有重復(fù)。圖4列舉了從使用IonWorks Quattro系統(tǒng)的Kv1.3 藥理試驗(yàn)中得出的集中分布數(shù)據(jù)。 每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)有每個(gè)濃度的4個(gè)副本組成—注意IonWorks
Quattro與IonWorks HT相比產(chǎn)生的誤差棒要短得多。
![圖 4. 在IonWorks H（左）和IonWorks Quattro系統(tǒng)（右）上測(cè)量的4-AP 對(duì)于CHO細(xì)胞上表達(dá)的 Kv1.3 通道的抑制作用IC50 值比較]()
hERG 藥理
在IonWorks Quattro系統(tǒng)上使用單孔和PPC 基片，測(cè)試八個(gè)具有已知的hERG 活性的參考化合物的效能(astemizole, cisapride, pimozide,
flunarizine, quinidine, terfenadine和dofetilide)。當(dāng)使用PatchPlate PPC基片時(shí)，對(duì)比單孔方式，數(shù)據(jù)變異性明顯降低(圖
5)。通過使用PatchPlate PPC基片和單孔值的比較，和以前報(bào)告的傳統(tǒng)全細(xì)胞膜片鉗電生理學(xué)值的比較，總結(jié)在表2中。
除了氟桂利嗪外，大多數(shù)值在文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)全細(xì)胞膜片鉗測(cè)得值的3倍平均值范圍內(nèi)。除了氟桂利嗪是一種起效緩慢的化合物，即使使用傳統(tǒng)的膜片鉗(數(shù)據(jù)未顯示)持續(xù)刺激10分鐘后，沒有達(dá)到穩(wěn)定抑制狀態(tài)
,導(dǎo)致觀察到在IonWorks Quattro右移，因?yàn)榇碳は抻?秒發(fā)出5個(gè)刺激。
![圖 5. 在IonWorks Quattro中對(duì)每個(gè)已知的hERG 化合物確定其效能。比較使用原來的PatchPlate（單孔，左側(cè)）和PatchPlate PPC (右側(cè)) 基片得到的值。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞接種密度對(duì)于單孔是5 x 105 細(xì)胞/mL，對(duì)于PPC是2 x 106細(xì)胞/mL。]()
表 2. 對(duì)于IonWork Quattro 和 IonWorks HT系統(tǒng)以及傳統(tǒng)的膜片鉗電生理學(xué)方法， hERG阻滯劑IC50 值的相關(guān)性 (單位 μM)。
| |
IC 50 (μM) |
| |
單孔 |
PPC |
傳統(tǒng) |
| Astemizole |
0.006 |
0.024 |
0.0009-0.026 |
| Cisapride |
0.008 |
0.051 |
0.0065-0.044 |
| Pimozide |
0.013 |
0.09 |
0.001-0.018 |
| Flunarizine |
0.483 |
1.82 |
0.107 |
| Quinidine |
0.47 |
1.66 |
0.300-1.1 |
| Terfenadine |
0.105 |
0.439 |
0.007-0.204 |
| Dofetilide |
0.015 |
0.016 |
0.010-0.158 |
| Imipramine |
5.59 |
8.28 |
3.4 |
與原來的 PatchPlate消耗品的兼容性
IonWorks Quattro 系統(tǒng)和原來的單孔PatchPlate和新的PatchPlate PPC消耗品都兼容。 為 IonWorks Quattro
系統(tǒng)設(shè)計(jì)了新的放大器，允許用戶在兩個(gè)PatchPlate 選項(xiàng)之間切換。 當(dāng)在開始每個(gè)試驗(yàn)，在軟件中配置試驗(yàn)協(xié)議時(shí)，用戶只要簡單選擇PatchPlate類型。
比IonWorks HT增加了4倍的通量
Population Patch Clamp技術(shù)比起IonWorks HT 系統(tǒng)，增加了4倍的通量—已經(jīng)是市場(chǎng)上最高的電生理學(xué)系統(tǒng)通量。 每年使用IonWorks
Quattro系統(tǒng)采集的數(shù)據(jù)點(diǎn)最高可達(dá)400,000。
減少每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的成本
由于IonWorks Quattro 系統(tǒng)通量的增加，相對(duì) IonWorks HT 系統(tǒng)，每個(gè)化合物的測(cè)量成本銳減了50%。
分子儀器公司有幾個(gè)具體的財(cái)務(wù)分析工具用于評(píng)估全負(fù)荷運(yùn)營費(fèi)用和毛利潤 ，可以和對(duì)建立離子通道感興趣的篩選服務(wù) CROs的分析不相上下。 了解更多信息，聯(lián)系當(dāng)?shù)豈DC 財(cái)務(wù)代表。
技術(shù)參數(shù)*
| 尺寸(英寸) |
55.6 (H) x 58.1 (W) x 32.5 (D) |
| 重量 (磅) |
550 (250 kg) |
| 所需真空 |
最小 120 mbar @ 0.6 m3/hr
26 in. Hg @ 0.35 cfm |
| 微孔板格式 |
支持標(biāo)準(zhǔn)的96- 和 384-通道格式 |
| PatchPlate 基片 |
支持原來的PatchPlate 和PatchPlate PPC 基片 |
| 測(cè)定時(shí)間 |
45-85 分種/384-孔 (由方法決定) |
| 集成12-通道移液器 |
準(zhǔn)確度: 3.5 μl時(shí)> 95%
精度: 3.5 μl時(shí)< 10% CV |
| 電壓鉗放大器 |
集成的 48-通道放大器，可切換支持原來的PatchPlate 和PatchPlate PPC 基片 |
*技術(shù)參數(shù)可能會(huì)發(fā)生變化。
Publications
1. A place for high-throughput electrophysiology in cardiac safety: screening hERG cell lines and
novel compounds with the IonWorks HT system. J Biomol Screen, 10(8): p. 832-40. (2006).
2. A quantitative assessment of hERG liability as a function of lipophilicity. Bioorg Med Chem Lett,
17(6): p. 1759-64 (2007)
3. Population patch clamp electrophysiology: a breakthrough technology for ion channel screening.
Molecular Biosystems (2007)
聯(lián)系電話：020-8767-9617