1、什么是活體電穿孔 活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過電場作用，導入動物目標組織或器官。由于這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用,并且效率較高。活體電穿孔法的原理很簡單,在直流電場作用的瞬間,細胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然后自行恢復。在此期間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進入細胞 。近年來活體電穿孔法用于轉(zhuǎn)基因研究的報道不斷增多,在基因治療方面的優(yōu)勢也日趨顯著,是一種很好的活體基因?qū)敕椒ā?br /> 活體電穿孔法可用于檢測瞬時表達系統(tǒng)中載體的表達狀況。大量的研究表明活體電穿孔法在基因治療方面有非常好的應用前景。因此目前國內(nèi)外對活體電穿孔法介導外源基因轉(zhuǎn)移的研究越來越多。
2、活體電穿孔的法的特點 活體電穿孔法基因?qū)牒捅磉_效率較高,它的特點主要在以下幾個方面:
首先,靶器官的選擇面廣,理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官。
在用于基因治療方面，要考慮到靶器官組織生理特性。如果所選擇的局部組織細胞不能把所轉(zhuǎn)移基因的表達產(chǎn)物分泌到外周血液循環(huán)中,則在某種意義上說已失去了基因?qū)氲膬r值,這在基因治療中是關鍵性的問題。當使用組織特異性表達載體時,研究人員應根據(jù)所構建的表達載體來選擇基因轉(zhuǎn)移和表達的靶器官組織。例如魚精蛋白21 啟動子可指導外源基因在精母細胞中特異性表達,以小鼠的睪丸作為靶器官將含有魚精蛋白21啟動子的表達載體導入,獲得外源基因的表達量遠遠高于該基因在肝臟和骨骼肌中的表達。
其次,對導入的外源基因片段的大小沒有限制,從幾KB 或十幾KB 的表達載體, 到100～200KB 的YAC、BAC 基因組,都有成功導入并獲得表達的報道。
此外活體電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。但電穿孔法也存在一些的缺點:首先,外源基因表達持續(xù)的時間很短,雖然外源基因?qū)牒笞羁炜稍?15 小時有表達,但大多1～2 月后表達量降至很低。外源基因表達的時間主要由于所構建的表達載體和基因?qū)氲陌屑毎M織器官不同而存巨大差異。由于應用不同的表達載體,Muramatsu 在小鼠肝臟進行電穿孔7天后則檢測不到外源基因的表達,而Heller 21 天后還可以檢測到外源基因的表達。如果選擇代謝和酶活動旺盛的組織器官如肝臟,則表達持續(xù)時間會較短,表達時間在1 個月以內(nèi),但以骨骼肌為靶組織,表達可持續(xù)15個月。
3、活體電穿孔法與其他活體基因?qū)敕椒ǖ谋容^ 到目前為止,非病毒載體的活體基因?qū)敕椒ㄓ兄苯幼⑸浞ā⒅|(zhì)體法、基因槍法、電穿孔法等。每一種方法都有其各自的特殊性,因此很難將這幾種方法進行簡單的比較。
直接注射法：可將外源基因直接注射到靶位點或血管中,但此種方法不適合以肌肉作為靶器官,它的外源基因表達效率極低,僅為電穿孔法的百分之一。
脂質(zhì)體法：活體基因轉(zhuǎn)移法中脂質(zhì)體法更適宜較大面積組織的基因?qū)?但無法避免DNA濃度變低,在出血的情況下會使本來不高的DNA濃度更加降低,往往造成基因?qū)胄实汀?br /> 基因槍法：適合于DNA較易接觸到的質(zhì)地較堅韌的組織如皮膚,而視網(wǎng)膜、胚胎和禽類的胚盤等組織會由于機械刺激和出血造成器質(zhì)性損傷或發(fā)育停滯,因而不能用基因槍法完成。DNA包裹的金屬顆粒從基因槍發(fā)出到達組織表面大多只幾百微米的距離,較深層的組織不易操作, 表達效率也較低。
Muramatsu報道在材料一致的情況下,電穿孔法的基因?qū)牒捅磉_效率明顯高于其它方法,而且電穿孔法適合多種組織的操作[3] 。
4、活體電穿孔法施加條件的研究 波型的選擇
在電穿孔過程中方波較指數(shù)衰減波更能獲得較高的基因表達。同時方波只要要求控制電壓和時間，十分直觀，而指數(shù)衰減波需要控制的電壓、電容、電阻等參數(shù)，這樣的條件摸索過程中，方波較指數(shù)衰減波更易得到高表達。